Cryopreservatie van zoogdiereicellen en embryo's werd tot dusver in de onderzoekseenheid van ons centrum onderzocht in verschillende projecten. Uit die studies konden verschillende conclusies getrokken worden:
- de metafaseplaat van menselijke eicellen wordt beschadigd na blootstelling aan koude en cryoprotectieve stoffen;
- de onmiddellijke morfologische overleving en de implantatiekans na transfer van menselijke eicellen is suboptimaal;
- niet alle menselijke embryo's overleven volledig intact de vries- en dooiprocedure; en
- de kans op zwangerschap na transfer van ingevroren en ontdooide embryo's bedraagt ongeveer 15% tegenover 25-30% voor niet gevroren embryo's.
Die bevindingen hebben ons ertoe aangespoord om het vriezen en dooien van menselijke eicellen en embryo's verder te onderzoeken.
Beschadiging van cellen die in vloeibare stikstof zijn opgeslagen gebeurt hoofdzakelijk tijdens het afkoelings- en ontdooiingsproces. Zonder speciale voorzorgen worden cellen, gekoeld tot subzero temperaturen, beschadigd door vorming van intracellulaire ijskristallen. Het doel van elke cryopreservatieprocedure bestaat erin te vermijden dat schadelijk intracellulair ijs ontstaat.
IJskristallen ontstaan eerst in het medium dat de cellen omgeeft door enting. Als gevolg van deze extracellulaire ijsvorming zal de electrolytenconcentratie rondom de cel toenemen en zal de cel water gaan verliezen door osmose. Het transport van water door de celmembraan heen is een beperkende factor bij het slagen van een invriesproces.
Een Amerikaans onderzoeker, Peter Mazur, ontwikkelde zo'n veertig jaar geleden een theoretisch mathematisch model dat de relatie beschreef tussen membraanwatertransport, koelsnelheid en intra-cellullaire ijsvorming. Dit mathematische model heeft geleid tot ontwikkeling van geoptimaliseerde protocols voor cryopreservatie van eicellen en embryo's van de muis, de koe en primaten.
Tot dusver werden menselijke eicellen en embryo's gevroren met methoden geoptimaliseerd voor muisembryo's. Empirische modificaties van het protocol werden doorgevoerd zonder enige wetenschappelijke achtergrond en hebben niet geleid tot overlevingspercentages zoals beschreven voor andere zoogdiersoorten.
Het theoretisch mathematisch model zou ons in staat moeten stellen geoptimaliseerde procedures vast te leggen voor eicellen en embryo's van de mens. Om gebruik te maken van dit model moeten essentiële biofysische karakteristieken van menselijke eicellen en embryo's gekend zijn. Die omvatten:
- hun osmotisch actief watergehalte,
- de waterdoorlaatbaarheid van de membranen,
- de activeringsenergie van deze waterdoorlaatbaarheid,
- de doorlaatbaarheid van membranen voor cryoprotectieve stoffen,
- de activeringsenergie voor de cryoprotectant doorlaatbaarheid,
- hun koudegevoeligheid, en
- hun tolerantie voor belangrijke volumeveranderingen.
De menselijke eicellen en embryo's nodig voor dit onderzoek zijn afkomstig van onrijpe (kiemblaasstadium) eicellen van patiënten bekomen na eierstokstimulatie in voorbereiding op een ICSI-behandeling. Deze eicellen zijn niet geschikt voor klinisch gebruik. Mits akkoord van de patiënten zullen deze onrijpe eicellen in-vitro gerijpt en na ICSI bevrucht worden. De koppels worden ingelicht over het onderzoek (informed consent) en kennen ook de exclusieve regels van het onderzoek op embryo's.
Het bepalen van meetbare biofysische karakteristieken en het meten van volumeveranderingen wordt methodologisch ook uitgetest op embryo's van de muis.
De bevindingen zullen getoetst worden aan bestaande literatuurgegevens. De methodologie voor de bepaling van meetbare biofysische karakteristieken is in detail beschreven door Leibo et al (1980) in Water permeability and its activation energy of fertilised and unfertilised mouse ova (J of Membr Biology, 53, 179-188). De theoretische achtergronden voor het mathematisch model zijn beschreven door Mazur P (1990) in Equilibrium, quasi equilibrium and non-equilibrium freezing of mammalian embryos (Cell biophysics, 17, 53-92).